测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线。要求这一 曲线为直线★，即测定信号与被测物浓度成正比★。 理想情况下工作曲线过原点； 直线的线性范围是有限的（高浓度端偏离）；通常要 求两个数量级以上的线性范围； 样品中被测物浓度应在工作曲线的线性范围内。 偏离比耳定律： 即工作曲线在高浓度端发生偏离。
分子吸收能量后受到激发★，分子就从基态能级跃迁到激发 态能级，因而产生吸收光谱★。 处于激发态的分子返回基态或能级较低的激发态，就会以 光子的形式释放能量，从而产生发射光谱★。
邻- 与间-羟基苯甲酸均含有能发射荧光的苯环，但取代基 的位置不同使它们具有不同的荧光性质； 碱性溶液中（pH12）★，二者在310nm附近紫外光的激发下 均发生荧光，而在中性偏酸性溶液中（pH5.5）只有邻-羟基 苯甲酸发荧光；对-羟基苯甲酸在上述两种条件下均不发生
一束单色光通过吸光物质的溶液后，光的吸收程度与 吸光物质微粒（分子）的数目（浓度c）成正比。即：
光源： 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯，波长范围 320-2500nm； 在紫外区使用氢灯或氘灯，波长范围180-375nm。
对于一个可能含有邻- 、间-和对-羟基苯甲酸的样品溶液， 先在pH5.5测定邻-羟基苯甲酸含量，然后在pH12测定邻- 与 间-羟基苯甲酸总量，计算得到间-羟基苯甲酸含量。
互补光：处于同一直 线上的两种光。 互补光按一定强度比 例混合，即得白光。
当b单位为cm，c的单位为mol/L时的吸光系数称摩尔吸 光系数，其单位为cm-1mol-1L。
A为吸光度; I0为入射光强 I为透过光强; T为透光度 k★’为比例常数 b为液层厚度（光程长度） b I0 I
灵敏度高。比UV-Vis高约3个数量级。 选择性好。首先能发生荧光的物质少★，且发生荧光的物质 还必须吸收一定频率的光（激发）★，即使不同物质都吸收了
玻璃吸收紫外光，所以玻璃棱镜仅用于350-3200nm波长 范围，只能用于可见分光光度计；石英（ 185-4000nm ） 则可用于整个紫外-可见光区。 光栅利用光的衍射与干涉作用，其优点是适用波长范围 宽、色散均匀★、分辨率高；但其缺点是各级光谱有重叠而 产生相互干扰。
1. 应用范围 既直接用于有色物测定，也通过显色用于无色物分析★； 既用于常量分析（1%），也用于微量分析（0.01-1%）; 既用于无机离子分析★，也用于有机物分析； 既用于定量分析，也可用于定性分析（特征吸收光谱、功 能基团特征吸收峰）★；
20.5 分光光度法仪器测量误差及消除 20.6 分光光度法的应用 20.7 荧光分光光度法
能级差与对应的光谱 价电子能级间能量差1-20eV★，紫外-可见光的能量★； 振动能级间能量差0.05-1eV★，红外光的能量； 转动能级间能量差10-4-0.05eV，远红外光及微波的能量。
物质分子的运动状态 分子轨道中价电子的高速旋转；原子在平衡位置的振动★； 分子自身的转动。 分子的能量
动能级★；跃迁回基态的各振 动能级★，并以光的形式释放 能量，此光即为荧光★。
20.1.1 分（吸）光光度法及其特点 比色法：利用有色溶液颜色的深度测定该溶液的浓度。 目视比色法★：用肉眼直接比较样品和标准溶液的颜色深浅★。 分光光度法★：用光电比色计或分光光度计测量溶液吸光度。
化学因素引起的偏离。其一是介质不均匀（胶体、乳浊液、 悬浮液）而产生折射、散射和反射★，使透过光强减弱（A增 大）。其二是吸光分子发生化学变化而改变浓度。
通常使用1cm比色池； 根据样品浓度和显色配合物的灵敏度高低，可以选用
入射光为非单色光时的偏离★。仪器的分光元件（单色器） 很难得到真正的单色光，而是波长范围很窄的复合光带， 而比耳定律仅在入射光为单色光时才是正确的。
荧光现象★：物质吸收波长较短的光后，发出波长较长的光。 可见（分子）荧光★：物质吸收波长较短的紫外光后，发出波 长较长的可见荧光★。 荧光分析法（荧光分光光度法）：利用分子荧光现象，测定 荧光强度，从而测定荧光物质或非荧光物质（衍生化）★。
灵敏度高。10-3 －10-6 mol/L。 准确度高。相对误差2－5％★。 仪器设备简单、操作简便。 应用范围广。
比尔定律本身的局限性★。比尔定律假设了吸光分子之间无 相互作用，事实上★，高浓度时分子间相互作用不可忽略。
差示分光光度法：用比样品浓度略低的标准溶液作参比代 替一般情况下的试剂空白参比，使测定吸光度数值在0.20.8范围内。
通常在最大吸收波长下测定吸光度，采用标准曲线. 多组分的测定 吸收光谱不重叠时，可在各自的最大吸收波长下分别测定★。 吸收光谱单向重叠，即组分1干扰组分2，而组分2不干扰组 分1的测定，这时只能直接测定组分1含量，要测定组分2含量★， 必须先用组分1的标准溶液测定出组分1在组分2的测定波长下 的摩尔吸光系数★，并用已测定出的组分1的浓度★，计算波长2 下组分1的吸光度，并从波长2下组分1和2的总吸光度中扣除 组分1的吸光度。 吸光度双向重叠。需解联立方程★。
用无色透明★、耐腐蚀的光学玻璃或石英制造。 因玻璃吸收紫外光，所以玻璃吸收池只能用于可见光区。 杯差★：一对比色池对光吸收的差异，实验前要先校杯差★。 检测系统：
透过率★：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶 液后，没有被吸收的光（即透过的光）的比例。 吸光度：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶
紫外-可见吸收光谱 分子中的价电子吸收特定波长的光（紫外-可见光）后， 从基态跃迁到激发态。
只有被测产物有吸收，其他反应试剂均无吸收时，可 用纯溶剂做参比； 显色剂或其他试剂有颜色时，用试剂空白做参比； 如果干扰物质也生成类似显色产物，也可按下法制备 一个参比溶液★：在显色之前先将被测物掩蔽起来★，只让 干扰物质显色，该空白溶液做参比便可消除干扰★。
吸收光谱曲线★：溶液对不同波长光的吸收强度★，即以入射 光波长为横坐标，吸光度为纵坐标所做的一条曲线。 最大吸收波长：物质对该波长的光吸收最大，即吸收光谱 曲线 比色法和分光光度法及其仪器
摩尔比法★：固定金属离子浓度[M]，改变配体浓度[L]，在小 于配合物组成比时，随着[L]/[M]比值的最大，形成的配合物 浓度最大，溶液的吸光度增加，达到配合物组成比之后，再 增加[L]★，即增加[L]/[M] 比值，形成的配合物浓度 已基本变，从吸光度A与 [L]/[M]的关系曲线
无机显色剂（硫氰酸盐、鉬酸铵★、双氧水等）与被 测物生成的有色物的稳定性、灵敏度和选择性都不高， 应用较少★。 有机显色剂（磺基水杨酸、二苯硫腙等）大多能与 金属离子形成稳定的有色配（螯）合物。
色散元件★：将连续光谱分解为单色光的元件（如棱镜、 光栅）★； 单色器：由入射狭缝、准直透镜、色散元件、聚焦透镜 和出射狭缝构成★。
有较好的选择性★； 生成的显色物（多为螯合物）稳定、组成恒定； 产物颜色应与被测物颜色有较大差异； 显色条件应易于控制。 萃取光度法： 当显色剂与被测物（通常是金属离子）生成的有色
分子吸收光而被激发，使 电子从基态上升至激发态， 处于某一振动状态； 分子碰撞而失去振动能量， 急剧降低至激发态中的最低 振动能级； 电子从激发态中的最低振
显色反应：将无色或吸光系数很小的被测物与显色剂反 应，使之转变成具有较强UV或Vis吸收的化合物后测定★。
分光光度法测定时★，吸光度读数通常要求在0.2-0.8范围 内★，误差最小是A=0.434★。 当测定浓度比较大的样品时，由于吸光度读数超出准确
